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cck8试剂实验过程中的疑难解答(二)
点击次数:69 发布时间:2018-03-22
1.哪些物质会影响cck8试剂的测定?
当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。
2.在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?
可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如:可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
3.设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?
不一定要设定。cck8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
4.说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板货12孔板,应该加多少量cck8试剂?
一般情况下建议加入cck8试剂的量是培养基体积的1/10。
5.在cck8试剂显色过程中,如何终止反应?
有一下几种方法(96孔板): 1、 在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。
6.必须预培养细胞吗?
不一定。如果要向保持细胞的zui好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
7.如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?
金属对cck8试剂显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。
8.cck8试剂的保存条件?
在避光条件下cck8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话,推荐在-20℃下保存。但是cck8试剂若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
9.预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
10.cck8试剂对于不同的细胞,灵敏度是否一样?
不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入cck8试剂培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长cck8试剂的加入时间或增加细胞数量来解决。
11.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?
悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。
12.应该每次做标准曲线吗?
建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。
13.有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?
不能。由于cck8试剂是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。
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